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    SUM149PT细胞 SUM149PT细胞 乳腺癌细胞(细胞培养中常见的生物污染类型有7种,分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染,那么他们污染细胞的特点分别是什么呢?怎样能够减少污染现象的发生?)

    1-细菌

    细菌污染常见的有大肠杆菌,葡萄球菌等。细菌污染较易发现,在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,培养液一般会在短时间内变黄,有时静置的培养液不混,稍加震荡会有很多混浊物漂起。显微镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮,有时在细胞表面及周围有大量细菌存在,细胞停止生长并有中毒表现。

    处理:①在培养液中加入相应的抗生素,能够预防绝大多数的细菌污染。

    2-真菌

    真菌污染是细胞培养过程中zui常见的一种,尤其梅雨季节快要到了,进行细胞培养时更易污染。污染细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不混浊,倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝,并悬浮飘荡在培养液中。

    很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠;念珠菌或酵母菌形态呈卵形,散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。

    真菌污染后,细胞生长变慢,但zui后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。真菌生长的比较慢,不象细菌那么容易被发现,但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了,也很难救活了。

    3-支原体

    支原体的大小介于细菌和病毒之间,是一种独立生活的微生物。对热敏感,对一般抗生素不敏感。支原体的形态多变,多吸附在细胞表面和细胞之间。电镜下观察,中心有高密度的密集颗粒,横断面与细胞微绒毛相似。

    因国内的血清大多数都没有做支原体阴性检测,而支原体又是牛血清中zui常见的微生物之一。支原体污染细胞后,培养液轻微发生混浊.但细胞变化不显著,随着细胞的培养会慢慢死亡。

    支原体污染检测(荧光染色法):DNA和与DNA特异性结合的荧光染料结合,使得支原体的DNA着色,然后用荧光显微镜观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

    解决:

    1)抗生素排除法:支原体污染预防比解决好。如果不小心污染后,可加入高浓度抗生素(常规使用的5倍浓度)作用24-48小时,再换入常规培养液,但该法不保证有效。推荐用量:庆大霉素 200μg/ml ,四环素10μg/ml ,卡那霉素50μg/ml 。

    2)加温除菌:支原体不耐热,可以对支原体污染的细胞热处理除菌。因高温对细胞本身也会产生一定影响,故热处理前需先进行预实验,确定对细胞影响zui小而能zui大程度的杀死支原体的时间。

    4-黑胶虫

    黑胶虫的存在目前尚有争议,其在低倍下为黑色点状,高倍下可看见黑色的小虫游来游去,培养液也是不浑的,对细胞生长状态不会有明显影响,在细胞增殖旺盛之后会自然消失,除更换血清外无须特殊处理。

    5-原虫

    培养液可轻微浑浊,显微镜下那些细小的点状物数量非常多,轻微活动,细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢,而且细胞状态不好,边缘不清楚,细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的,但他们的数量小,细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长,只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长,zui终形成恶性循环。

    6-病毒

    组织细胞培养过程中,如果没有除去潜在的病毒,就会产生病毒污染。目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。 尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的。因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

    7-非同种细胞污染

    即细胞交叉污染,由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开,往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前,世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染,致使许多实验宣告无效。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。

    污染是细胞培养的大敌,预防和避免污染是成功培养细胞的关键之一。危机意识要贯彻实验的始终,否则不仅浪费时间,而且浪费人力、物力,甚至造成无法弥补的损失。

    (如何预防细胞培养的污染和清除这些污染物呢?)慧颖 细胞库 技术为您解答:

    一、污染的预防

    预防是防止细胞培养过程中发生污染的zui好办法。只有预防工作做在前,才能将发生污染的可能性降到zui小程度。一般预防可从以下几方面着手:

    1-从操作者做起

    1操作者责任心要强,要细心稳重,操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟,按规定穿隔离衣。进入后关好门,坐下来尽量少走动。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物,不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内,更不能随便使用,以免造成大批污染。

    2、操作者动作要轻,必须在火焰周围无菌区内打开瓶口,并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话,若打喷嚏或咳嗽应转向背面。

    3、操作时要常更换吸管,切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾,保持实验室清洁整齐,zui后用消毒水浸泡的纱布擦台面。

    2-从物品、用品消毒灭菌着手

    细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底,各种溶液灭菌除菌要仔细,并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。

    3-防止细胞交叉污染

    在进行多种细胞培养操作时,所用器具要严格区分,zui好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作,避免一起进行时易发生混乱。

    在进行换液或传代操作时,注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口,以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。

    所有细胞一旦购置,或从别处引入,或自己建立,均应及早留种冻存,一旦发生污染可弃之复苏,重新培养。

    二、污染的清除

    培养细胞一经污染,多数较难处理。如果污染细胞价值不大,宜弃之;有细胞株留存的或可购置的,可在寻找原因后彻底消毒操作室,复苏或重新购置细胞,再培养。若污染细胞价值较大,又难于重新得到,可采取以下办法清除。

    1-使用抗生素

    抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL),污染后清除用药需采用大于常用量5~10倍的冲洗法,于加药后作用24~48小时,再换常规培养液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外,还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、制霉菌素等。常用400~800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四环素处理,每隔2~3日换液1次,传1~2代进行治疗。近年来有报道,4-氟,2-羟基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四环素衍生物(BM-2)等三种抗生素单用或合用对杀灭支原体有效。这三种抗生素均用PBS配成250浓缩液,-20℃保存备用,使用浓度Cip为10μg/mL,BM-1为10μg/mL,BM-2为5μg/mL。使用时先吸除污染的培养液,加入含BM-1的RPMI1640培养液,3天后再吸除培养液,加入含BM-2的RPMI1640培养液,培养4天,如此连续3个轮次,直至用33258荧光染色镜检证明已清除支原体后,再加正常培养液培养传代3-4次。

    2-使用支原体特异性血清

    用5%的兔支原体免疫血清(血凝效价1:320以上)可去除支原体污染,因特异抗体可抑制支原体生长,故经抗血清处理后11天即转为阴性,并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦,不如用抗生素方便、经济。

    3-加温处理

    将污染的组织培养物放在41℃培养18小时,可杀死支原体,但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验,摸索能zui大限度杀死支原体又对细胞影响zui小的加热时间。此法有时不可靠。若先用药物处理后,再以41℃加温处理效果更佳。

    4-其他方法

    除了上述去除污染的方法外,还有动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等,但均较麻烦,且效果不确定。所以一旦支原体污染,除非有特别重要价值,一般均弃之重新培养。

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